本作中Ezio剛邁入天命之年,已被奉為刺客宗師,並統領著以兄弟會為核心的刺客組織,享受著因為打敗羅馬地區的聖殿騎士團而帶來的和平。但此時的Ezio並未選擇致力栽培後進的退休生涯,而是為刺客家族走上探尋之旅,希望能解開如結般橫亙心頭的眾多迷團。依照家族文獻的線索,Ezio必須前往敘利亞地區,那裡正是刺客組織的發源地,初代主角Altaïr曾經活躍的舞台……
而前往異鄉的Ezio將遇到另一支刺客組織,並和當地的刺客宗師Yusuf Tazim進行文化交流(其實是被Yusuf Tazim來段下馬威)。雖然他們沒有達文西,但是版圖橫跨歐亞非、文明昌隆的鄂圖曼土耳其帝國,培養出的刺客們依然有許多本事讓Ezio大開眼界,包括炸彈的製作和鉤刃使用,將作為新要素在遊戲中登場:
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